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细胞自噬检测

技术简介:微管相关蛋白1轻链3(LC3/Atg8)是自噬体膜上的标记蛋白。细胞内存在两种形式的LC3蛋白,LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。细胞内新合成的LC3其C端被Atg4蛋白酶剪切,成为胞质可溶形式的LC3-Ⅰ。当自噬体形成后,LC3-Ⅰ经剪切和泛素化加工修饰.与自噬体膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)偶联,成为膜结合形式的LC3-Ⅱ并定位于自噬体内膜和外膜。与其他一些定位于自噬体膜上的Atg蛋白不同(仅在自噬过程的某一阶段发挥作用),LC3-Ⅱ始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合,因此被用来作为自噬体的标记分子。LC3-Ⅱ的含量或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例与自噬体的数量成正相关,在某种程度上反映了细胞的自噬活性。

1. LC3蛋白表达水平的检测  蛋白质印迹技术是一种比较普遍使用的检测蛋白质表达的方法。SDS-PAGE电泳中,LC3-I表观分子量为18kD,LC3-Ⅱ的表观分子量为16kD。自噬发生后,通过Westemblot可以检测到LC3-Ⅱ蛋白的表达水平上调(图5-7-4)。需要指出的是,比较LC3-Ⅱ的水平,仅能反映自噬体的数量,LC3-Ⅱ表达的多少并不意味着自噬活性的强弱

 LC3荧光鼬合蛋白检测  为了对自噬发生过程进行动态检测,用分子生物学的手段,将LC3和绿色荧光蛋白(GFP)做成可真核表达GFP-LC3融合蛋白的表达质粒。GFP荧光稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白能力比荧光素强。将GFP-LC3质粒转染入目的细胞,24小时后就可用荧光显微镜进行活体动态观察。正常牛理环境下,LC3在胞质内弥散分布。自噬激活时,LC3-Ⅱ聚集于自噬体膜上。通过转染GFP-LC3融合蛋白的表达,理论上,根据GFP荧光颗粒聚集的密集程度和分布可反映Lc3的表达水平和细胞内定位,因此可以判断细胞自噬的发生情况。如图5-7-5所示,正常状态下,GFP-LC3融合蛋白弥散在胞质中;自噬诱导后,在荧光显微镜下可观察到明亮的绿色荧光斑点。GFP-LC3的转染可以考虑使用瞬时表达或稳定表达。同时,计数GFP-LC3荧光颗粒的数目可以定量分析自噬的水平高低。

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