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COIP检测

1)技术简介:

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是研究蛋白质一蛋白质相互作用的常用技术,通常用于测定两种已知蛋白质能否在细胞内结合产生相互作用,以及用于确定与某种特定蛋白质具有相互作用的未知蛋白质。该法的优点是蛋白质处于天然状态,蛋白质的相互作用可以在天然状态下进行,可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白质复合体。

Co-IP的原理与免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)大致相似,都由特异抗体与待检样品中相应的特异抗原结合形成抗原一抗体免疫复合物,然后复合物吸附于固化了蛋白A或G的支持物上(蛋白A或G具有吸附抗体的能力),相应的抗原分子也同时被吸附。免疫复合物被吸附到支持物上的过程即为沉淀(Precipitation)。没有被沉淀的蛋白质随着缓冲液的流洗而被除去。但在免疫共沉淀中,与靶抗原一起被沉淀的还有靶抗原的相互作用蛋白质,即随着抗体被吸附于固化了蛋白A或G的支持物上,相应的抗原及其相互作用蛋白质也同时被沉淀。最后,采用相互作用蛋白质的特异抗体经Western Blot检测,以证实二者存在相互作用。

2)实验步骤/流程图:

总蛋白提取:

细胞样品准备:3000rpm离心5min收集细胞,PBS漂洗,加入适量modified RIPA Buffer(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min,然后于4℃,12000rpm离心20min取上清;

组织样品准备:取适量组织,PBS漂洗,加5倍体积预冷的modified RIPA Buffer于冰上充分匀浆,约5min,然后于4℃,12000rpm离心20min取上清;

取少量上清以备WesternBlot分析,剩余上清加1μg相应的抗体,4℃缓慢摇晃孵育过夜;

proteinA beads 预洗:取10μL protein A beads,用适量modifiedRIPA Buffer洗3次,每次3000rpm离心3min,再用modified RIPA Buffer调整成体积比为50%混悬液;

将预洗的10μLprotein A beads加入2)中和抗体孵育过夜的modified RIPA Buffer,4℃缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A beads充分偶连;

4℃,3000rpm离心3min,弃上清,1mLmodified RIPA Buffer洗3-4次;加入15μL的2×SDS上样缓冲液,沸水煮5分钟;

WesternBlotting分析,确定结合蛋白。

3)客户需提供资料:

  样本以及对应的抗体

4)最终提供客户资料:

  详细实验报告,含所需试剂耗材、仪器设备、操作过程

5) 示例展示:


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